BIU-87人膀胱癌細(xì)胞實(shí)驗(yàn)操作步驟

細(xì)胞傳代與擴(kuò)增

當(dāng)細(xì)胞密度達(dá)到80%-90%時(shí)，需進(jìn)行傳代操作。棄去舊培養(yǎng)基，用預(yù)冷的PBS輕柔洗滌2次以去除殘留血清。加入1 mL 0.25%胰蛋白酶（含EDTA），37℃孵育1-2分鐘，顯微鏡下觀察細(xì)胞回縮變圓后，立即加入含血清的培養(yǎng)基終止消化。吹打制成單細(xì)胞懸液，按1:3至1:5比例分裝至新培養(yǎng)瓶，補(bǔ)充適量培養(yǎng)基后置于孵箱繼續(xù)培養(yǎng)。注意記錄傳代次數(shù)，避免細(xì)胞狀態(tài)因過度傳代而下降。

細(xì)胞凍存與復(fù)蘇

凍存：取對數(shù)生長期細(xì)胞，消化離心后棄上清，用預(yù)冷的凍存液（90%血清+10%DMSO）重懸至1×10?/mL，分裝至凍存管，標(biāo)記細(xì)胞名稱、代次及日期。程序性降溫：4℃ 30分鐘→-20℃ 2小時(shí)→-80℃過夜，最后轉(zhuǎn)入液氮長期保存。

復(fù)蘇：從液氮中快速取出凍存管，37℃水浴震蕩至融化，酒精消毒后轉(zhuǎn)移至15 mL離心管，緩慢加入5 mL預(yù)溫培養(yǎng)基，離心去除DMSO。沉淀用新鮮培養(yǎng)基重懸，接種至培養(yǎng)瓶，24小時(shí)后更換培養(yǎng)基以去除死細(xì)胞碎片。

實(shí)驗(yàn)質(zhì)量控制

- 無菌操作：超凈臺(tái)需提前紫外滅菌30分鐘，操作中避免手部跨越開放容器。

- 交叉污染排查：定期通過STR鑒定確認(rèn)細(xì)胞株身份，顯微鏡下觀察形態(tài)是否均一。

- 數(shù)據(jù)記錄：詳細(xì)記錄接種密度、處理時(shí)間及異常現(xiàn)象（如顆粒增多、空泡化等）。

?常見問題與解決方案

- 生長緩慢：檢查血清批次活性或調(diào)整接種密度。

- 污染處理：若出現(xiàn)真菌污染（菌絲狀漂浮物），立即廢棄培養(yǎng)物并用0.1%過氧乙酸清潔孵箱。